Королёв был арестован 27 июня 1938 года, после ареста Ивана Терентьевича Клеймёнова и других работников Реактивного института. Арест Королёва санкционировал М. Ю. Рагинский — заместитель Генерального прокурора А. Я. Вышинского. Постановление на арест Королёва писал Жуковский. Основания для ареста: показания И. Т. Клеймёнова и Г. Э. Лангемака, В. П. Глушко — все трое называли С. П. Королёва соучастником контрреволюционной троцкистской организации внутри РНИИ, «ставящей своей целью ослабление оборонной мощи в угоду фашизму». Следствие по делу вели лейтенанты оперуполномоченные НКВД Быков Николай Фёдорович[19] и Шестаков Михаил Николаевич[20][21].

Его обвинили по статье 58-й, по двум её пунктам: 58-7 — «Подрыв государственной промышленности …, совершённый в контрреволюционных целях путём соответствующего использования государственных учреждений и предприятий, или противодействие их нормальной деятельности» — и 58-11 — «Всякого рода организационная деятельность, направленная к подготовке или совершению предусмотренных в настоящей главе преступлений …». Королёва обвиняли в том, что с 1935 года он проводил преступную работу по срыву отработки и сдачи на вооружение РККА новых образцов вооружения.

О применении к нему избиений и издевательств следователями сам Королёв утверждал в своём письме на имя И. В. Сталина от 13 июля 1940 года с просьбой объективно расследовать его дело[22]. Журналист Я. К. Голованов[21][23] подвергал эту версию сомнению, так как по его мнению доказательства отсутствуют.

25 сентября 1938 года Королёв был включён в список лиц, подлежащих суду Военной коллегии Верховного суда СССР. В списке он шёл по первой (расстрельной) категории[24][25]. Список был завизирован Сталиным, Молотовым, Ворошиловым и Кагановичем[26].

Королёв был осуждён Военной Коллегией Верховного Суда СССР 27 сентября 1938 года, обвинение: ст. 58-7, 11. Приговор: 10 лет ИТЛ, 5 лет поражения в правах. 13 июня 1939 года Пленум Верховного Суда СССР отменил приговор Военной Коллегии Верховного Суда СССР, а следственное дело по обвинению Королёва было передано на новое расследование, в ходе которого Королёв показал, что данные им показания на следствии в 1938 году не соответствуют действительности и являются ложными:

«УТВЕРЖДАЮ»
ЗАМ. НАЧ. ГЛАВ. ЭKOHOM. УПР. НКВД СССР
СТ. МАЙОР ГОСУДАРСТВЕННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ
/НАСЕДКИН/
29 мая 1940 года
ОБВИНИТЕЛЬНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
по следственному делу № 19908 по обвинению Королёва Сергея Павловича по ст.ст. 58-7; 58-11 УК РСФСР.
28 июня 1938 года НКВД СССР за принадлежность к троцкистской, вредительской организации, действовавшей в научно-исследовательском институте № 3 (НКБ СССР) был арестован и привлечён к уголовной ответственности бывший инженер указанного института Королёв Сергей Павлович.
В процессе следствия Королёв ПРИЗНАЛ СЕБЯ ВИНОВНЫМ в том, что в троцкистско-вредительскую организацию был привлечён в 1935 году бывшим техническим директором научно-исследовательского института № 3 Лангемаком (осуждён).
По заданию антисоветской организации Королёв вёл вредительскую работу по срыву отработки и сдачи на вооружение РККА новых образцов вооружения (л.д. 21-35, 53-55; 66-67, 238—239).
Решением Военной Коллегии Верховного Суда СССР от 27 сентября 1938 года Королев был осуждён к 10-ти годам тюремного заключения.
13 июня 1939 года Пленум Верховного Суда СССР приговор Военной Коллегии Верховного Суда СССР отменил, а следственное дело по обвинению Королёва было передано на новое расследование (см. отдельную папку судебного производства).
В процессе повторного следствия Королёв показал, что данные им показания на следствии в 1938 году не соответствуют действительности и являются ложными (л.д. 153—156).
Однако имеющимися в деле материалами следствия и документальными данными Королёв изобличается в том, что:
В 1936 году вёл разработку пороховой крылатой торпеды; зная заранее, что основные части этой торпеды — приборы с фотоэлементами — для управления торпеды и наведения её на цель, не могут быть изготовлены центральной лабораторией проводной связи, Королёв с целью загрузить институт ненужной работой усиленно вёл разработку ракетной части этой торпеды в 2-х вариантах.
В результате этого испытания четырёх построенных Королёвым торпед показали их полную непригодность, чем нанесён был ущерб государству в сумме 120 000 рублей и затянута разработка других, более актуальных тем (л.д. 250—251).
В 1937 году при разработке бокового отсека торпеды (крылатой) сделал вредительский расчёт, в результате чего исследовательские работы по созданию торпеды были сорваны (л.д. 23-24, 256).
Искусственно задерживал сроки изготовления и испытания оборонных объектов (объект 212) (л.д. 21, 54, 255).
На основании изложенного обвиняется
КОРОЛЁВ СЕРГЕЙ ПАВЛОВИЧ, 1906 года рождения,
урож. гор. Житомира, русский, гр-н СССР, беспартийный,
до ареста — инженер НИИ-3 НКБ СССР,
в том, что:
являлся с 1935 года участником троцкистской вредительской организации, по заданию которой проводил преступную работу в НИИ-3 по срыву отработки и сдачи на вооружение РККА новых образцов вооружения, то есть в преступлениях ст.ст. 58-7, 58-11 УК РСФСР.
Виновным себя признал, но впоследствии от своих показаний отказался.
Изобличается показаниями: Клейменова, Лангемака, Глушко; показаниями свидетелей; Смирнова, Рохмачева, Костикова, Шитова, Ефремова, Букина, Душкина и актами экспертных комиссий.

Дело по обвинению Королёва направить в Прокуратуру Союза ССР по подсудности.
Обвинительное заключение составлено 28 мая 1940 года в гор. Москве.

СЛЕДОВАТЕЛЬ СЛЕДЧАСТИ ГЭУ НКВД СССР
МЛ. ЛЕЙТЕНАНТ ГОСБЕЗОПАСНОСТИ /РЯБОВ/
ПОМ. НАЧ. СЛЕДЧАСТИ ГЭУ НКВД CССP
CT. ЛЕЙТЕНАНТ ГОСБЕЗОПАСНОСТИ /ЛИБЕНСОН/
«СОГЛАСЕН» НАЧ. CЛЕДЧАСТИ ГЭУ НКВД СССР
МАЙОР ГОСУДАРСТВЕННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ
/ВЛОДЗИМИРСКИЙ /"

— Королёва Н. С. Арестованный № 1442: Из книги об отце. // Наше наследие. 2000. № 54.
Десятого июня 1940 года срок сокращён до 8 лет ИТЛ, освобождён в 1944 году.

По его заявлению в Военную прокуратуру от 30 мая 1955 года реабилитирован «за отсутствием состава преступления» 18 апреля 1957 года[27][28].

21 апреля 1939 года попал на Колыму, где c 3 августа находился на золотом прииске Мальдяк Западного горнопромышленного управления и был занят на так называемых «общих работах»[30].

Бороться за пересмотр дела С. П. Королёва первой начала его мать М. Н. Баланина, заручившись поддержкой депутатов Верховного Совета СССР М. М. Громова и В. С. Гризодубовой. Приговор от 27 сентября 1938 года был отменён и дело передавалось на новое рассмотрение[30]. В результате С. П. Королёв 23 декабря 1939 года был направлен с прииска Мальдяк в распоряжение Владлага[28][31] и потом в Москву на пересмотр дела. По дороге с прииска С. П. Королёв заболел и оказался в лазарете. Он опоздал в Магадане на последний рейс парохода «Индигирка» перед закрытием навигации. Возможно, это спасло Сергея Павловича от смерти: пароход затонул в Японском море во время шторма, погибло 696 из 1173 человек на борту.

В Москву прибыл 2 марта 1940 года, где спустя четыре месяца был судим вторично Особым совещанием, приговорён к 8 годам заключения и направлен в московскую спецтюрьму НКВД ЦКБ-29, где под руководством А. Н. Туполева, также заключённого, принимал активное участие в создании бомбардировщиков Пе-2 и Ту-2 и одновременно инициативно разрабатывал проекты управляемой аэроторпеды и нового варианта ракетного перехватчика.